24 Marzo 2021

Cellule somatiche differenziali: Macrofagi, Linfociti e Neutrofili

Associazione Italiana Allevatori

La
mastite è una patologia infiammatoria del tessuto parenchimatico della
ghiandola a mammaria causata prevalentemente da batteri e dalle loro tossine
(Sharma et al., 2006) che causa cambiamenti fisici, chimici e batteriologici
nel latte oltre che provocare alterazioni patologiche nel tessuto ghiandolare
della mammella (Sharma, 2007). Tale patologia, oltre ad incidere negativamente
sul benessere dell’animale, rappresenta anche un problema economico e di salute
animale, in quanto deprime la produzione e la qualità del latte prodotto e
rende il latte prodotto dalla ghiandola mammaria infetta non utilizzabile dall’uomo
(Ruegg, 2017).

Come
riportato da Zecconi e Zanirato (2013) e da Zecconi (2010) la mastite può
essere classificata in base a tre parametri:

• presenza di patogeni nel latte (esame batteriologico)

• contenuto di cellule somatiche del latte (esame citologico)

• eventuale presenza di segni clinici (esame clinico)

 In base a tali criteri si possono definire
diverse forme di mastite:

  1. infezione latente (con esame
    batteriologico positivo, cellule somatiche <100.000 u/ml ed assenza di
    segni clinici); è la fase iniziale della mastite, che può evolvere nelle
    forme più gravi (mastite subclinica o clinica) o guarire naturalmente,
    grazie all’intervento delle difese immunitarie dell’animale. Questa forma
    non determina ancora perdite produttive significative, ma è un importante
    segnale di allarme
  2. Infiammazione (con esame batteriologico positivo,
    cellule somatiche tra 100.000 e 200.000 u/ml, assenza di segni clinici);
    può essere lo stadio iniziale o finale di una forma clinica o subclinica
    e, come nel caso precedente, può guarire naturalmente, grazie
    all’intervento delle difese immunitarie dell’animale. Questa forma è
    associata a perdite produttive lievi.
  3. Mastite subclinica (con esame batteriologico positivo o
    negativo, cellule somatiche superiori a 200.000 u/ml, assenza di segni
    clinici); è la forma più frequente nelle bovine, anche se passa
    inosservata se non vengono effettuate analisi del latte (es. controlli
    funzionali) e determina perdite produttive in termini sia qualitativi (es.
    minore resa casearia) sia quantitativi. Il mancato isolamento di un agente
    batterico (esame batteriologico negativo) non indica che la causa della
    mastite subclinica sia diversa da quella batterica, ma semplicemente che
    la concentrazione dei batteri era al momento dell’analisi inferiore al
    limite di rilevamento della tecnica diagnostica applicata, oppure che i
    batteri erano già stati eliminati dalla risposta infiammatoria. I capi con
    mastite subclinica sono dei "serbatoi" di microrganismi che
    possono diffondere l'infezione in vacche ancora non infette.
  4. Mastite clinica (con esame batteriologico positivo o
    negativo, cellule somatiche molto elevate, segni clinici evidenti. Questa
    forma è rilevabile visivamente, si manifesta con alterazioni del latte
    (presenza di fiocchi, frustoli di fibrina, aspetto sieroso) e/o della
    mammella (aumento di volume, arrossamento, dolore, secrezione ridotta o
    assente) e, nella forma più grave con risentimento generale. Le mastiti
    cliniche sono spesso l’evoluzione delle mastiti sub-cliniche, passate inosservate.
    Va sottolineato che se la mastite clinica è sempre associata ad un elevato
    contenuto cellulare del latte (anche > 1.000.000 u/ml), non è però vero
    il contrario, ovvero si possono avere bovine con elevatissimo contenuto
    cellulare del latte in assenza di segni clinici nella mammella.
  5. Mastite cronica. E’ l’evoluzione
    in forma cronica delle forme subcliniche e cliniche che non guariscono e
    consiste in un’infezione mammaria persistente accompagnata da rialzo del
    contenuto cellulare che rimane elevato per più di 4 settimane,
    generalmente associata a progressivi indurimenti e/o presenza di noduli a
    livello del parenchima mammario.

Una
bovina è sana quando ha tutti i quarti della mammella sani, cioè quando ogni
quarto ha batteriologia negativa e cellule somatiche < 100.000 u/ml.

Nel
latte sono sempre presenti due categorie di cellule:

-
leucociti o “globuli bianchi”: queste cellule sono di origine ematica e sono
presenti nel latte proveniente da mammelle sane in concentrazioni inferiori a
100.000 u/ml. Questo numero aumenta considerevolmente in situazioni patologiche
potendo raggiungere e superare il milione u/ml.

-
cellule epiteliali: sono cellule provenienti dalla desquamazione della mucosa
che riveste internamente la mammella; questo tipo di cellule si riscontrano
normalmente e non rivestono un significato patologico.

Sia
nel latte di bovine sane sia in quello di bovine con mastite clinica o
subclinica ed indipendentemente dal numero di totale di cellule, più del 90%
delle cellule somatiche nelle bovine sono leucociti, mentre meno del 10% sono
cellule epiteliali.

L’indicatore
più utilizzato per l’individuazione della mastite nella lattifera è la conta di
cellule somatiche (SCC) nel latte che viene rilevato a partire dal campione di
latte prelevato durante il controllo funzionale. La valenza di indicatore di
mastite di questo dato deriva dal fatto che le cellule somatiche sono coinvolte
nella risposta immunitaria all’infezione della ghiandola mammaria. Anche se Il
SCC nel latte è influenzato da molti fattori, quali la specie dell’animale, il
livello di produzione di latte, la fase di lattazione e le pratiche di gestione
dell’animale stesso in azienda (Rupp et al.,2000) , esso viene usato come
indicatore della qualità del latte specialmente nei ruminanti (Sharma et al.,
2011) e di fatto la conta di cellule somatiche nel latte (analisi citologica),
anche in assenza di un isolamento di patogeni, può dare utili indicazioni sullo
stato sanitario della mammella, informazione fondamentale per la prevenzione
dall’insorgenza della mastite. Il definire una infezione a livello mammario
permette di intervenire, a livello sanitario, con opportune terapie
antibiotiche che permettano di risolvere lo stato infettivo riportando l’organo
al normale stato fisiologico.

Dai
dati dei controlli funzionali emerge che il numero di bovine con cellule
elevate in Italia è abbastanza rilevante. I grafici 1 e 2 mostrano i valori
medi e l’incidenza di vacche con cellule superiori a 200.000 dal 2015 al 2018.
I parametri rappresentati sono la media ponderata delle cellule (media delle
cellule somatiche ponderata con i kg di latte prodotto) e la percentuale di
capi con cellule alte (>200.000) separata per ordine di parto. I grafici
mostrano i valori mensili dei due parametri, con una netta differenza tra
primipare e pluripare, ed evidenziano come oltre il 30% delle vacche pluripare
abbia cellule superiori a 200.000 per tutto il corso dell’anno.

Figure 1 e 2 Andamento del numero medio di cellule per capo e di capi infetti nella razza rappresentativa dei bovini da latte Frisona Italiana nell’ultimo quadriennio completo

Limitando l’analisi al 2018,
possiamo tracciare una mappa delle cellule per ciascuna regione Italiana, senza
distinzione tra primipare e pluripare. Come si può notare in tutte le regioni
del Nord Italia (Piemonte, Lombardia, Trentino Alto Adige, Veneto, Friuli
Venezia Giulia ed Emilia Romagna) la percentuale di vacche con cellule alte
supera sempre il 25%.

Avere il numero di cellule somatiche
totali individuali presenti nel latte (dato rilevato da tempo dai controlli
funzionali e, quindi, non incluso nel progetto LEO) rappresenta però un’informazione
parziale dello stato di infezione della mammella; come visto, non è detto
infatti che un livello molto basso di cellule somatiche rappresenti la
situazione ideale per una bovina, ma risulta essenziale, ai fini di una
corretta prevenzione e cura, conoscere la quantità di singoli componenti delle
stesse sul totale.

È noto che non solo il conteggio totale delle cellule somatiche (SCC), ma anche la composizione delle cellule somatiche cambia significativamente durante il processo di mastite. In particolare, il SCC in un latte proveniente da quarti di mammella sani è basso e consiste principalmente di macrofagi e linfociti (Lee et al., 1980; Schwarz et al., 2011; b; Pilla et al., 2012); nel latte di una ghiandola mammaria infetta, invece, si può rilevare un elevato numero totale di cellule di neutrofili (PMN) (Paape et al., 2002). Questi cambiamenti nella composizione delle varie componenti dei leucociti derivano dalle rispettive funzioni delle singole cellule immunitarie (Sordillo et al.,1997; Oviedo-Boyso et al., 2007): i linfociti regolano l'induzione e la soppressionedi risposte immunitarie, mentre i macrofagi riconoscono l'invasione dei patogeni della mastite e iniziano la risposta immunitaria avviando un massiccio afflusso di PMN. Oltre a ciò, i macrofagi fagocitano batteri, detriti cellulari e componenti del latte accumulati ed operano la riparazione dei tessuti. Le cellule PMN, infine, difendono la mammella dai batteri all'inizio di un'infezione. La letteratura scientifica conclude che oltre alla determinazione del SCC totale, la differenziazione delle celle fornisce preziose informazioni aggiuntive per una descrizione più precisa di l'attuale stato di salute della mammella delle vacche da latte (Pillai et al., 2001; Rivas et al., 2001; Pilla et al., 2013). L’andamento delle cellule differenziali durante un’infezione può essere sinteticamente riassunto dalla figuradi seguito in cui sono rappresentati gli andamenti delle tre popolazioni cellulari durante una infezione.

Figura 4. Andamento del SCC e dei tre componenti delle cellule somatiche nel corso dell’infezione (da FOSS)

La ditta Foss ha recentemente messo in commercio uno
strumento di analisi FOSSOMATIC 7 DC (fig.2) che permette la valutazione del
parametro DSCC (Differential Somatic Cell Count) che quantifica le differenti
parti delle cellule somatiche, dando così un’informazione che viene chiamata
Cellule Somatiche Differenziali.

Lo strumento permette di analizzare e quantificare sia SCC che DSCC in 600
campioni per ora. La metodica di analisi utilizzata da questo tipo di strumento
è descritta da Damm et al. (2016): il DSCC, ossia il SCC differenziale è un
nuovo parametro per lo screening della mastite a partire da campioni di latte e
rappresenta la proporzione combinata di 2 tipi di cellule del latte (PMN e
linfociti) espressi in percentuale. La proporzione di macrofagi è calcolata
sottraendo DSCC dal 100%. La figura 6 riporta le fasi della determinazione di
DSCC.

Figura 6. Fasi della determinazione delle famiglie cellulari (da Damm et al., 2016)

La separazione analitica fra i vari
componenti del latte (punti grigi) e cellule somatiche (punti neri) viene
effettuata in un primo passaggio attraverso i canali di fluorescenza (figura 6
A.); solo le cellule somatiche rilevate in questa fase sono poi utilizzate per
determinare DSCC utilizzando due canali di fluorescenza (FL1 e FL2)
differenziando i macrofagi (grigio chiaro) dai linfociti e PMN (grigio scuro)
(figura 6 B.) con ingrandimento maggiore.

Il pattern di variazione della
proporzione nel latte dei macrofagi, linfociti e neutrofili (PMN) e della
presenza di cellule somatiche per unità di volume dipende del tipo di infezione
in corso nella mammella.

In un quarto sano la maggior parte
dei leucociti è rappresentata da linfociti (70%), seguita da macrofagi (20%) e
pochi PMN (10%).

In presenza di un’infezione
mammaria, le cellule somatiche passano attivamente dal sangue al latte dove
aumentano di numero, cambiando le loro proporzioni. Infatti, al crescere della
gravità della malattia (da infiammazione a mastite subclinica o a mastite clinica)
il numero di cellule aumenta progressivamente con un altrettanto progressivo
aumento dei PMN (fino a 70-80%) e una corrispondente diminuzione dei linfociti
(fino a 5-10%). Il motivo di questi cambiamenti è la necessità di avere in
mammella cellule in grado di distruggere i patogeni entrati nella mammella
attraverso il processo della fagocitosi, azione svolta principalmente dai PMN.

 Nel caso delle mastiti croniche, che sono una
conseguenza della mancata guarigione dei casi precedenti, si osserva un’ulteriore
modifica con un livellamento del numero di cellule attorno a valori di
400-800.000 u/ml ma con una preponderanza (>50%) di macrofagi a discapito
dei PMN, mentre i macrofagi tendono a essere percentualmente più elevati nella
fase di guarigione.

Il parametro DSCC è stato utilizzato in recenti
studi svolti da DIMEVET Università degli Studi di Milano (prof. A. Zecconi) in
collaborazione con ARAL, per determinare i valori soglia per la classificazione
delle bovine in base alla percentuale DSCC e al contenuto di cellule somatiche.
Il valore delle cellule differenziali consente di ottenere quattro livelli di
rischio sanitario in funzione della fase di lattazione

Avere quindi a disposizione
l’informazione sulla composizione differenziale delle cellule somatiche, oltre
che il loro numero complessivo, rappresenta un’utile informazione per definire
lo stato sanitario delle bovine che permette di definire anche l’entità dell’infezione
e dosare la quantità di antibiotici proporzionalmente al livello di infezione
anziché intervenire con dosi elevate.

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