24 Marzo 2021

Integrità di membrana

Istituto Lazzaro Spallanzani

L’inseminazione
artificiale, nelle varie specie zootecniche, ha ormai da qualche tempo
soppiantato le tradizionali tecniche di monta naturale occupando un ruolo
fondamentale nella gestione della riproduzione. In particolare, per i bovini
rappresenta il principale strumento operativo per la selezione. La fecondazione
artificiale viene eseguita solitamente con il seme congelato che, per tale
specie, consente di ottenere risultati, in termini di fertilità paragonabili a
quelli del seme fresco, sempreché le procedure di congelamento/scongelamento
siano adeguate e che l’eiaculato disponibile sia di ottima qualità. Per
l’allevatore l’obiettivo principale non può che essere la fertilità, mentre il
parametro qualitativo seminale maggiormente correlato ad essa è il numero di
spermatozoi vitali dopo scongelamento, valutazione che può essere determinata
grazie a diverse analisi quali la misura della concentrazione, della motilità e
dell’integrità di membrana. Nonostante la costante diminuzione della fertilità
che si registra ormai da anni sia stata attribuita quasi unicamente al cambio
di modalità di gestione della bovina, bisogna considerare che parte di tale
calo è legato al maschio. La fertilità del toro può dipendere dalla qualità del
seme e dal livello di fertilità intrinseca del toro stesso. La qualità del seme
può essere controllata e aumentata agendo su alcune caratteristiche seminali, mentre
non può essere aumentata la componente intrinseca della fertilità di un toro.
Diversi studi condotti a partire dal 2000 hanno confrontato i principali
parametri seminologici misurati su tori di razza Frisona con gli stessi
parametri misurati negli anni ’70: i vari autori hanno concordato che volume,
concentrazione e numero totale di spermatozoi dell’eiaculato non mostravano
differenze significative. Gli autori hanno quindi ipotizzato che
l’individuazione di parametri aggiuntivi per valutare la qualità spermatica da
associare ai parametri seminologici classici potesse aumentare la probabilità
di una corretta predizione della fertilità, ritenendo altresì che la
valutazione seminologica classica (volume, concentrazione e motilità) sia utile
per identificare infertilità o sub-fertilità ma non sufficiente per predire il
livello di fertilità del seme. Ad oggi, lo stato di membrana rappresenta uno
dei maggiori presupposti per la definizione di normalità funzionale di uno
spermatozoo. Infatti, se è vero che la motilità è essenziale affinché uno
spermatozoo sia fecondante e che uno spermatozoo con acrosoma perso o rotto o
con gravi anomalie di coda non è mobile, è altrettanto vero che uno spermatozoo
mobile può possedere la membrana della testa alterata ed è proprio la porzione
della membrana della testa che consente il riconoscimento prima e la fusione
poi fra le cellule spermatozoo e uovo. La cellula spermatica, come ogni altra
cellula, risulta essere avvolta completamente da una membrana plasmatica a
doppio strato fosfolipidico i cui componenti principali sono lipidi e
colesterolo. La composizione specifica in lipidi e colesterolo varia da specie
a specie, da individuo a individuo e per lo stesso individuo da eiaculato a
eiaculato. Questa specificità può essere correlata non solo alla velocità di
capacitazione ma anche alla fertilità del soggetto in esame nonché alla sua
resistenza al processo di congelamento (good e bad freez/cooler). La membrana
plasmatica dello spermatozoo è una struttura molto specializzata che ne modula
le interazioni con l’ambiente esterno. Essa è organizzata in una serie di
domini regionali che contengono numerosi lipidi e proteine che funzionano
insieme per regolare determinati aspetti della fisiologia e della funzione
spermatica. Ad esempio, i domini della membrana che riveste la porzione
intermedia del flagello contengono proteine vitali per la produzione
mitocondriale di ATP e necessarie per la modulazione dello scorrimento dei
microtubuli; diversamente, i domini di membrana che ricoprono la testa
contengono proteine e lipidi importanti nel riconoscimento cellula-cellula e
nella fusione cellulare.

Per quanto riguarda le componenti proteiche, la
membrana plasmatica degli spermatozoi presenta la maggior polarità tra tutti i
tipi cellulari. Tutte le proteine della membrana plasmatica dello spermatozoo
che sono state caratterizzate mostrano una specifica localizzazione nella
membrana che riveste la testa, il tratto intermedio o la porzione principale
del flagello. Questa localizzazione precisa subisce delle importanti
riorganizzazioni durante lo sviluppo dello spermatozoo, la maturazione
epididimale, il transito nelle vie genitali femminili, la capacitazione e la
fecondazione. Il completamento della capacitazione, almeno per quanto riguarda
gli spermatozoi coinvolti nella fecondazione, è un evento peri-ovulatorio.
Infatti, gli spermatozoi completamente capacitati sono cellule instabili, con
scarse riserve energetiche, con membrane destabilizzate e fragili, con enzimi
acrosomiali labili e dunque, ad emivita breve. Per questo motivo, se uno
spermatozoo compie precocemente la capacitazione, non sarà funzionale a lungo e
non sarà in grado di penetrare l’oocita quando quest’ultimo raggiungerà il sito
di fecondazione. È oramai assodato che gli svariati fattori fisici e biologici
che si verificano, e che influenzano la sopravvivenza dello spermatozoo durante
il processo di crioconservazione (cold shock), come la formazione di cristalli
di ghiaccio, lo stress ossidativo, i cambiamenti osmotici e la riorganizzazione
del doppio strato lipidico, spesso coinvolgono l'integrità della membrana. Se
da un lato è vero che le tecniche di crioconservazione sono progredite
lentamente negli anni passati, proprio i recenti progressi nella comprensione
della struttura della membrana cellulare, della sua funzione e del suo
metabolismo hanno portato a nuovi sistemi di conservazione il cui futuro appare
promettente, tra cui la liofilizzazione e la vitrificazione. E’ inoltre
importante sottolineare che la valutazione dell’integrità della membrana non ha
solo valenza in ambito di crioconservazione, in quanto tale parametro può
risultare compromesso anche dall’utilizzo di altre tecnologie applicate al
materiale seminale, come nel caso del sessaggio del seme. A tale proposito,
occorre ricordare che la semplice diluizione del materiale seminale, oltre ad
indurre effetti osmotici, presumibilmente rimuove delle importanti molecole
naturali ad azione antiossidante e altri componenti benefici contenuti nel
plasma seminale necessari per il mantenimento dell'integrità della membrana
degli spermatozoi.

Determinazione dell’integrità di membrana

L’integrità della membrana plasmatica (IM)
classicamente viene valutata mediante metodi basati sulla colorazione degli
spermatozoi con ioduro di propidio (IP) che è un fluorocromo impermeabile alla
membrana plasmatica e che emette fluorescenza rossa quando si intercala alla
doppia elica del DNA. Proprio per queste caratteristiche, le molecole di IP si
legano al DNA degli spermatozoi con membrana plasmatica danneggiata emettendo
alta fluorescenza rossa, mentre gli spermatozoi con membrana plasmatica integra
non mostrano fluorescenza rossa in quanto il fluorocromo non può attraversare
la membrana plasmatica integra e quindi legarsi al suo target. Come detto, per
quanto riguarda il bovino la tecnica elettiva per la fecondazione è
l’inseminazione artificiale effettuata con seme crioconservato. In
considerazione di questo, le analisi di laboratorio vengono svolte su materiale
seminale scongelato per poter valutare anche la suscettibilità al congelamento
del seme del riproduttore. Il dato di integrità di membrana di ogni lotto di
seme analizzato è ottenuto utilizzando il NucleoCounter SP100 (ChemoMetec,
Allerød, Danimarca) secondo le istruzioni del costruttore. Lo strumento è
composto da un microscopio a fluorescenza integrato, un campionatore e un
sistema di analisi d’immagine. L’analisi viene effettuata grazie all’ausilio di
cassette SP1 (ChemoMetec) contenenti IP in polvere. Lo strumento rileva la
fluorescenza rossa degli spermatozoi con membrana plasmatica danneggiata che,
passando all’interno della cassetta si sono colorati con IP, riportandone il
numero di spot fluorescenti per mL.

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