18 Maggio 2021

Stima della digeribilità e del livello di ingestione di alimenti negli animali da reddito

Dall'introduzione, negli anni '60, dell’uso della
tecnologia NIRS (Near Infrared Spectroscopy) per misurare l'umidità nei
cereali, il numero delle sue applicazioni analitiche è notevolmente aumentato.
La spettrometria nel vicino infrarosso si basa sull'assorbimento differenziale
della luce in alcuni segmenti della gamma spettrale tra 714 - 2500 nm (14000 -
4 000 cm-1) da parte di vari legami chimici.

Le calibrazioni NIR si basano sull'analisi statistica,
definita "chemiometria", della relazione tra spettri trasformati
matematicamente che sono dati dal reciproco della riflettanza [log (1 / R)], e
i dati primari misurati con metodi di riferimento nella matrice organica.

La diffusione di strumenti di costo relativamente
contenuto e con la possibilità di operare una scansione continua su tutto il
range spettrale, nonché la disponibilità di applicazioni software dedicate per
lo sviluppo di calibrazioni e analisi spettrali, hanno contribuito notevolmente
all'espansione dell’utilizzo di questa tecnologia. Inoltre, questa presenta
alcuni vantaggi che la differenziano dalle metodiche analitiche standard, e che
ne hanno favorito l’utilizzo: l’analisi non è distruttiva (e i campioni quindi
riutilizzabili), non comporta l’uso di sostanze chimiche e solventi, offre la
possibilità di analisi direttamente in campo e possibilità di ottenere
contemporaneamente da un singolo campione molteplici parametri analitici.  A questi pregi si può aggiungere il ridotto
costo unitario di analisi e la possibilità di analizzare un elevato numero di
campioni in tempi anche molto brevi, condizioni essenziali per poter operare
controlli su vasta scala, ad esempio nell’ambito di programmi di selezione
genetica.

La qualità delle calibrazioni NIRS può essere valutata in
termini di linearità e accuratezza. La linearità è indicata dal coefficiente di
determinazione (R2), ovvero la proporzione di variabilità nei dati
di riferimento spiegata dall'equazione di regressione. L'errore standard di
calibrazione (SEC) rappresenta la variabilità nella differenza tra valori
previsti e valori di riferimento quando l'equazione è stata sviluppata dal set
di dati di calibrazione. Dopo che è stata elaborata una calibrazione con R2
e SEC elevati, è necessario un metodo di validazione, in cui ne viene valutata
la reale capacità predittiva. Anche se l'accuratezza può essere valutata sulla
base della pendenza dell'equazione di validazione, altre stime di accuratezza,
ovvero gli errori standard di predizione (SEP) e di cross-validazione (SECV)
risultano solitamente più efficaci. Il SEP rappresenta la variabilità nella
differenza tra valori previsti e valori di riferimento quando l'equazione viene
applicata a un set di dati di validazione esterno, non utilizzato quindi in
nessuna fase della calibrazione. Il SECV rappresenta la variabilità nella
differenza tra valori previsti e valori di riferimento quando l'equazione viene
applicata in sequenza ai sottoinsiemi di dati dal set di dati di calibrazione.
La sola valutazione del SECV può fornire risultati troppo ottimisti, in
particolare se i dati vengono replicati, ma può essere giustificata in
situazioni con campioni di calibrazione che sono stati scelti a caso da una
popolazione naturale (Naes et al., 2002). Inoltre, il SECV non consente di
valutare la distorsione, ovvero la differenza media tra i valori previsti ed
effettivi in un set di dati di convalida e di correggere i valori previsti di
conseguenza. Sebbene il SEP risulti superiore al SECV, soprattutto quando la
robustezza a lungo termine delle equazioni NIR è una delle maggiori
preoccupazioni, entrambi parametri sono ampiamente utilizzate come indici di
precisione in letteratura e nella pratica. Quando si considerano i dati, si
deve tener conto dell'intervallo di valori per cui è impostata la calibrazione
NIRS: un SECV di 3,0 punti percentuali è più accettabile ad esempio per un
parametro quale la fibra detergente neutra (NDF) che ha un range di variabilità
ampio (dal 30 all'80% circa) nel foraggio rispetto ad esempio alla lignina
(compresa ad esempio tra il 5 e il 15% nelle monocotiledoni). Una calibrazione
NIRS è considerata ideale se la capacità predittiva presenta un errore di
ordine simile a quello ottenibile con i metodi tradizionali di "chimica
umida", ovvero le procedure analitiche di laboratorio utilizzate per
fornire i valori di riferimento. Questa situazione già si verifica per molte
applicazioni e la spettrometria nell’infrarosso è già da tempo considerata una
tecnologia standard per l’analisi del contenuto in azoto e in fibra di diversi
alimenti concentrati e fibrosi (Barton e Windham, 1988).

Con riferimento ai potenziali usi del NIRS nella
determinazione della composizione chimica e botanica delle diete dei ruminanti,
due sono stati gli approcci più frequentemente adottati. Il primo, e più
consolidato, metodo si basa sull'analisi diretta degli spettri dell’alimento ed
è particolarmente utile quando può essere più o meno facilmente ottenuto un
campione rappresentativo della dieta o quando sono sufficienti valutazioni di
gruppo per quanto concerne l’assunzione di alimento o la digeribilità. Il
secondo approccio, più innovativo e con grandi potenzialità in diverse
condizioni operative, si basa sull'analisi degli spettri fecali ed è
principalmente rilevante quando non è possibile ottenere facilmente campioni di
dieta rappresentativi, ad esempio negli animali al pascolo, o quando è
richiesta la conoscenza dell'assunzione di un singolo animale in un gruppo,
come negli studi di efficienza.

Valutazione del valore nutrizionale utilizzando gli
spettri NIR di diete e alimenti

In un primo rapporto sui test di qualità del foraggio di
NIRS risalenti a metà degli anni 70 (Norris et al., 1976), i valori di SEP per
le concentrazioni in sostanza secca (DM) di proteine grezze (CP), fibra neutro
detersa (NDF), fibra acido detersa (ADF ) e lignina al detergente acido (ADL)
erano rispettivamente 0.95, 3.1, 2.5 e 2.1%, ma il miglioramento degli
spettrometri NIR e dei metodi chemiometrici ha portato già all’inizio degli
anni duemila ad una ulteriore maggiore accuratezza (Dryden, 2003). Tra le
predizioni basate sulla NIRS della qualità del foraggio, le calibrazioni
"ristrette" di singole specie sono spesso, ma non sempre, più accurate
delle calibrazioni "generali", comprensive di più specie e che mirano
a includere una più ampia varietà spettrale. È necessario quindi trovare il
compromesso migliore tra la robustezza di una calibrazione, vale a dire la sua
capacità di prevedere le caratteristiche di set di campioni che presentano
un'ampia variabilità, come quelli tipici dei prati o pascoli naturali oppure di
feci di animali alimentati con diete molto differenti, da un lato, e
l'accuratezza delle previsioni, dall’altro. Una soluzione a questa diatriba può
essere l’impiego di calibrazioni che mantengono una loro specificità pur
all’interno di una calibrazione molto più generale. Per rispondere a un tale
quesito comparando le prestazioni di tecniche di calibrazione classiche
(globali) e innovative (locali) Tran et al. (2010) hanno operato su ampio
insieme di campioni costituito da un set che includeva 1.322 coppie dieta-feci,
utilizzato per sviluppare calibrazioni globali e locali. Le equazioni globali
hanno consentito di ottenere una precisione soddisfacente (R2> 0,8, errore
standard relativo di predizione (RSEP) tra il 10 e il 20%), ma le equazioni
locali hanno prodotto una precisione che è stata valutata come buona (R2>
0,8, RSEP <10%) o eccellente (R2> 0,9, RSEP < 10%) per la previsione
dell'assunzione e della digeribilità della razione. Durante la validazione
delle equazioni utilizzando un dataset esterno di campioni, entrambe le
tecniche si sono dimostrate comunque solide, con valori RSEP (8%) e R2
(0,82) simili. I risultati supportano nel complesso la capacità dei NIR fecali
di prevedere con successo e in modo più accurato le proprietà della dieta
(assunzione, qualità e digeribilità) con tecniche di calibrazione locali
rispetto alle classiche tecniche globali, in particolare su una serie di dati
mediati.

Numerosi studi hanno utilizzato la spettroscopia nel
vicino infrarosso per esaminare la composizione e le caratteristiche delle feci
degli erbivori. Le feci contengono una vasta gamma di informazioni sulla dieta,
la fisiologia e l'ecologia dell'animale al pascolo (Holechek et al., 1982;
Putman, 1984; Kohn and Wayne, 1997; Schwarzenberger et al., 1997) e un
approccio che sfrutti queste informazioni ha l'ovvio vantaggio di poter
ottenere informazioni anche quando gli animali non possono essere direttamente
campionati, ma anche di risultare molto meno invasivo nei confronti degli
animali stabulati. Molte caratteristiche della dieta, delle feci e degli
animali di interesse possono essere, o potenzialmente essere, misurate con
questa tecnica. Poiché la efficienza nella produzione di carne o latte bovini
od ovicaprini dipende anche da un'alimentazione adeguata, la comprensione e la
manipolazione della nutrizione dei ruminanti per una produzione efficiente in
termini sia tecnici che economici ed ambientali è un aspetto di grande
rilevanza nella attuale zootecnia.

Nel
caso di animali allevati al pascolo la spettroscopia NIR è stata utilizzata per
facilitare l'analisi dei componenti delle feci con l'obiettivo di utilizzare
queste informazioni per prevedere alcune caratteristiche della dieta. La
tecnica è stata anche applicata per misurare la composizione delle feci, delle
deiezioni miste (feci e urina) o del compost derivato da questi materiali, per
lo sviluppo di procedure per la gestione dello smaltimento degli escrementi (ad
esempio, come fertilizzante) onde ridurre l’impatto ambientale (Coates, 2004;
Landauet al., 2006; Benini et al., 1992).

L’importanza di poter misurare in condizioni di campo e
possibilmente su larga scala, due dei parametri basilari per la valutazione
dell’efficienza produttiva delle bovine da latte, quali sono l’ingestione di
alimenti e la digeribilità delle diete, è universalmente riconosciuta, come
pure sono ben note le difficoltà di misura ad esse connesse. I risultati di uno
studio progettato appunto per ottenere informazioni sulla capacità predittiva
della tecnica NIRS applicata alle feci di bovine da latte circa l'assunzione di
alimento e la digeribilità della razione (Garnsworthy e Unal, 2004)
offrono spunti molto interessanti. Gli autori hanno infatti posto a confronto
l'uso della tecnologia NIRS con l’impiego di tecniche più consolidate ma molto
più impegnative quale l’impiego di alcani di sintesi utilizzati come marcatori
interni. La DMI (media 19.4, s.d. 5.06 kg / giorno) è stata stimata con errori
standard di 0.36 e 0.44 kg / giorno quando gli alcani C32 e C36 erano
analizzati mediante gascromatografia, e con un errore standard pari a 0.48 kg /
giorno (R2 = 0.97) quando la predizione veniva effettuata sulla base degli
spettri delle feci. Meno accurata ma comunque potenzialmente utilizzabile a
fini pratici è risultata la capacità predittive della digeribilità della
sostanza secca mediante NIRS (errore standard di validazione incrociata =
0.032; R2 = 0.68), verosimilmente ascrivibile alla limitata variabilità dei
valori di digeribilità all'interno del set di dati. Di estremo interesse quindi
la possibilità di una previsione della DMI sulla base degli spettri NIRS delle
feci, con accuratezza simile alle stime derivate dalla tradizionale tecnica
fondata sui marcatori, ma molto promettente anche la potenzialità predittiva
della stessa tecnica anche nei riguardi della digeribilità della dieta.

Jancewicz et al. (2016) riportano i risultati di una
ricerca condotta su bovine allo scopo di testare la tecnologia NIRS per
prevedere la composizione chimica delle feci e la digeribilità apparente
riferita all’intero tratto digerente (aTTD). L’interesse di questo studio
risiede principalmente sul confronto operato tra diverse durate di raccolta
delle feci: un campione preso a intervalli di 4 ore dal pasto del mattino
oppure un campione ogni 24 ore ma per 4 giorni consecutivi. Le calibrazioni
NIRS per la previsione della TTD sono state elaborate usando sia i singoli
campioni presi con intervalli di 4 ore o i campioni formati dai 4
sotto-campioni raccolti ogni 24 ma per 4 giorni consecutivi. La maggior parte
dei campioni di intervallo di 4 ore potrebbe essere utilizzata per prevedere la
digeribilità delle diete per cui campioni fecali “spot”, raccolti in qualsiasi
momento da più bovini hanno un buon potenziale per prevedere la digeribilità
della dieta consumata. L’interesse di questi risultati è certamente notevole,
ma deve essere sottolineato come la tempistica del campionamento dopo
l'alimentazione debba però essere standardizzata, in quanto ogni momento di campionamento
è legato alla digeribilità da equazioni differenti.

Nella valutazione di un qualsiasi modello predittivo è
importante conoscere il grado di attendibilità della stima. Questo argomento è
stato affrontato in un recente lavoro (Decruyenaere at al., 2015) che si è
focalizzato sull’errore di predizione e sulla ripetibilità della spettroscopia
NIRS applicata a campioni di feci. I parametri oggetto di stima erano
l’ingestione di alimento e la digeribilità di un ampio dataset di foraggi.
L’interesse del lavoro risiede anche nel fatto che sono stati interessati alla
ricerca sia ovini che bovini. Partendo dal principio fondamentale e valido per
qualsiasi metodo indiretto di stima che l'errore di previsione delle
calibrazioni, NIRS nello specifico, dipende dall'accuratezza e dalla precisione
dei dati di riferimento, lo studio in oggetto riporta che la variabilità nei
dati primari di riferimento per OMD, DMVI e OMVI era inferiore al 10% dei
rispettivi valori medi. Questi dati relativi all'errore nel metodo di
riferimento sono stati utilizzati per operare una correzione sui risultati
delle predizioni, con dimezzamento circa dell'errore di previsione standard
(SEP) per la digeribilità della sostanza organica, ridottosi a 0,0155. Per
quanto concerne l’ingestione volontaria di sostanza secca, il SEP corretto è
risultato pari a 8.9 g / kg di peso metabolico, simile al SEP apparente. Sulla
base di questi risultati gli autori ritengono che tali risultati suggeriscano
che le calibrazioni NIRS da loro sviluppate siano sufficientemente precise per
prevedere in modo adeguato la digeribilità dei foraggi ma probabilmente non
l’ingestione volontaria di alimento. Buona invece per tutti i parametri è
risultata la ripetibilità degli spettri e delle previsioni NIRS, essendo la ripetibilità
della previsione inferiore o simile all'errore standard di convalida incrociata
(SECV) della calibrazione FNIRS.

In Italia, Decandia et al.(2007) operando su diete per
ovini a base di cereali, polpe di barbabietola ed erba medica, hanno sviluppato
calibrazioni NIRS con statistiche soddisfacenti (R2 ≥ 0.92 e RPD ≥
2.7) relative ad alcune frazioni azotate, quali l’azoto non proteico e quello
insolubile in detergente neutro o acido, ma meno efficienti per le proteine
vere e le proteine insolubili (R2 = 0,84-0,88 e RPD = 2,1–2,2).  Lyons et al. (2016) hanno studiato le
potenzialità della tecnica FTIR (medio infrarosso) per l’analisi di
composizione delle feci ovine e la stima della digeribilità della dieta nonché
del livello di ingestione. Per lo scopo sono stati impiegate quattro diverse
diete a base di erba. I campioni fecali sono stati raccolti durante due diversi
esperimenti per valutarne la digeribilità su pecore. Quarantuno campioni di
alimento e 132 di feci sono stati analizzati per composizione chimica, ne è
stata misurata la digeribilità e sono stati scansionati usando la spettroscopia
FTIR. I dati sono stati analizzati utilizzando, per lo sviluppo delle
calibrazioni, due diversi approcci chemiometrici: analisi delle componenti
principali (PCA) e regressione parziale dei minimi quadrati parziali (PLS).
L'accuratezza e le prestazioni della calibrazione sono state valutate
calcolando rispettivamente il coefficiente di regressione della validazione
incrociata (R2cv) e il rapporto tra previsione e deviazione (valore RPD).
Alcune delle equazioni di regressione PLS generate erano comparabili a quelle
riportate in letteratura e sulla base delle statistiche di calibrazione e
validazione quelle sviluppate per il contenuto in ceneri e in NDF erano buone e
potevano essere utilizzate per la quantificazione (R2cv = 0.9-0.8, RPD =
3.0-2.5); quelli per la ADL, ADL e la digeribilità della sostanza secca (DMD)
erano adeguati per un'analisi qualitativa e per lo screening (R2cv = 0,8-0,7,
RPD = 2,3–2,0). Infine, le equazioni di calibrazione per l’ingestione di
sostanza secca e di energia grezza, nonché della digeribilità di quest’ultima
risultavano invece scarse e inadatte a scopi previsionali (R2cv ≤ 0,7, RPD ≤
1,8).

Le potenzialità della tecnica NIRS per la stima di
parametri di efficienza digestiva sono state oggetto di approfondita indagine
anche nel settore avicolo, dove le condizioni di allevamento consentono un
elevatissimo numero di repliche. Nell’ambito di ricerche volte al miglioramento
delle tecniche di selezione genetica nel pollame, Bastianelli et al. (2005)
hanno condotto studi di digeribilità su circa 2000 polli da carne per valutare
differenze nella capacità digestiva di una medesima dieta standard. Le feci,
dopo essicazione e macinazione anche in questo caso, sono state impiegate per
la registrazione dei rispettivi spettri NIRS, impiegati quindi per lo sviluppo
di modelli predittivi della capacità digestiva dei singoli animali. La
previsione del contenuto in energia lorda nelle feci è risultata molto
accurata, con un errore standard in cross validazione (SECV) di 0.14 MJ.kg-1 ,
valore molto prossimo a quello ottenuto con la metodica di riferimento, e un
RPD (rapporto tra deviazione standard e SECV) molto elevato (9.2), consentendo
l'uso dei valori di energia grezza delle feci stimati in questo modo nei
calcoli della digeribilità pur mantenendo alti livelli di attendibilità. I
valori previsti per la digeribilità dell’energia ottenuti in questo modo sono
risultati pressoché sovrapponibili a quelli calcolati in base alla misura
diretta del contenuto energetico delle feci misurato mediante bomba
calorimetrica (R² = 0,999 senza valori anomali), grazie anche al fatto che
nelle formule di calcolo includevano comunque il valore della quantità di feci
emessa, misurato direttamente. Tuttavia, anche la predizione della digeribilità
dell’energia lorda direttamente dagli spettri NIRS fecali ha prodotto un SECV
del 2,1% e un RPD di 5,3, che va considerato di estremo interesse per tale
parametro. Anche questi risultati indicano che la digeribilità lorda
dell'energia può essere prevista con una ragionevole accuratezza direttamente
dalle feci, almeno nel pollame. Questo punto è estremamente promettente poiché
evita la misurazione dell'esatta assunzione di alimenti e della produzione
fecale, che sono molto impegnativi e richiedono molto tempo durante
l'esecuzione di esperimenti di digeribilità.

Anche nei suini la digeribilità apparente potrebbe essere
una valida misura alternativa dell'efficienza alimentare (FE), tuttavia essa
richiede anche in questo caso la misurazione dell'assunzione individuale di
mangime di un gran numero di animali, che risulta costosa e richiede un
considerevole impegno anche in termini di tempo. Un recente studio norvegese
(Nirea et al., 2018) ha inteso valutare in quale misura la composizione chimica
delle feci e la digeribilità apparente dei nutrienti possano essere previsti
usando la tecnologia NIRS. Campioni fecali per l’analisi degli spettri nel
range della radiazione infrarossa insieme a informazioni dettagliate sulla
composizione chimica delle feci e sulla digeribilità dei nutrienti sono stati
ottenuti da quattro diversi esperimenti condotti su suini. La robustezza e la
capacità predittiva dei modelli sono state valutate in questo caso in base ai
valori di R2 e dalla vicinanza tra SEC (errore standard di
calibrazione) e SECV (errore standard in cross-validazione) e in base a tali
criteri la capacità predittiva della spettrometria infrarossa è risultata
buona. I modelli sviluppati per stimare la digeribilità dei singoli nutrienti
hanno fatto registrare i seguenti parametri: R2 = 0.94; SEC = 5.5;
SECV = 6.7 per la digeribilità della sostanza organica; R2 = 0,88;
SEC = 2,3; SECV = 2,6 per la digeribilità dell’energia. Meno soddisfacenti
invece le performance dei modelli sviluppati per valutare la digeribilità del
grasso (R2 = 0,69; SEC = 11,7, SECV = 12,3), delle proteine (R2
= 0,63; SEC = 2,3; SECV = 2,7) e della NDF (R2 = 0,64, SEC = 7,7,
SECV = 8,8). Nel complesso quindi l’impiego della tecnica NIRS in programmi di
allevamento suino su larga scala si è dimostrata di notevole interesse.

Un approccio interessante consiste anche nel mettere in
relazione diretta gli spettri acquisiti sulle feci con quelli relativi agli
alimenti o all’intera dieta. Questo approccio ha dimostrato in alcuni casi di
potere migliorare anche sensibilmente la misurazione di importanti aspetti
della dieta selezionata dagli animali al pascolo, tra cui la concentrazione di
proteine, la digeribilità e, in alcuni casi, anche l'assunzione volontaria di
foraggio.

Conclusioni.

Sulla base della letteratura esaminata la tecnologia NIRS
applicata alle feci di vacche da latte ma anche di altre specie di interesse
zootecnico ha dimostrato di rappresentare una valida alternativa alle tecniche
tradizionali e di riferimento per la misura di diversi parametri di
composizione dei campioni stessi ma dimostra anche interessanti possibilità per
la misura della digeribilità e dell’ingestione volontaria della dieta. Tenendo
in considerazione i bassi costi di analisi, esclusi quelli connessi
all’acquisizione iniziale della strumentazione, la tecnologia NIRS rappresenta
una soluzione di estremo interesse soprattutto nell’ambito di progetti di
miglioramento genetico, ove si rende necessario il monitoraggio di un elevato
numero di animali e in condizioni di campo.

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