Descrizione del parametro: proAKAP4 è una proteina specifica dello sperma considerata come marcatore molecolare della qualità e fertilità maschile nei tori e, più in generale, nei mammiferi. Spermatozoi senza proAKAP4/AKAP4 sono anormali, immobili e sterili.
Possibili Applicazioni: la stima della qualità del materiale spermatico è molto utile ai fini del miglioramento genetico e all’ottimizzazione del management di un’azienda zootecnica.
Metodo di analisi: Il principio di funzionamento fa riferimento alla consolidata metodica ELISA, nello specifico della tipologia “sandwich”, che mira a rilevare e quantificare la proteina proAKAP4 in campioni di sperma di toro di vario tipo: eiaculato fresco, materiale seminale refrigerato e/o congelato in diluitore, spermatozoi isolati. La metodica richiede che la proteina debba essere prima rilasciata dalle cellule spermatiche utilizzando uno specifico tampone di lisi in proporzione (v:v) strettamente dipendente alla tipologia di materiale seminale e relativa concentrazione di spermatozoi (Milioni/ml). Quindi, nella fase successiva i lisati cellulari dei campioni vengono caricati su una micropiastra a 96 pozzetti contenente un primo anticorpo legato al fondo di ogni singolo pozzetto che catturerà ed immobilizzerà la proteina proAKAP4. Il complesso antigene/anticorpo verrà in seguito identificato utilizzando un secondo anticorpo accoppiato covalentemente alla perossidasi di rafano (metodo sandwich). Una soluzione di substrato aggiunta a ciascun pozzetto consentirà di sviluppare diversi livelli di colore (blu) la cui intensità sarà proporzionale alla concentrazione di proAKAP4 presente in ciascun pozzetto. Al termine di un periodo di incubazione ottimizzato, la reazione viene interrotta utilizzando una specifica soluzione e la rilevazione del segnale prodotto generato dalla reazione finale dovrà essere effettuata immediatamente tramite spettrofotometria misurando l’intensità del colore (giallo) a 450 nm prima che decada spontaneamente. La quantificazione di proAKAP4 nei campioni potrà, infine, essere dedotta utilizzando un’apposita curva standard di tipo lineare che consente il calcolo della concentrazione espressa in ng/ml.
Unità di misura: ng per 10 milioni di spermatozoi (ng/10M spz).
